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1、免疫組化和HE染色的對比

免疫組化染色和HE染色的不同之處可能是HE染色比較粗略地辨認不同細胞形態(tài)學改變；而后者能夠針對特異性細胞標志物來檢測特異性細胞的改變（數(shù)量）、也可檢測細胞內(nèi)細胞因子的轉(zhuǎn)位，組織中一些特異性蛋白的表達的量改變（通過圖像分析系統(tǒng)分析顏色深淺、分布的面積等綜合分析）。

通俗的講，HE僅僅是看大體病理改變，比如組織壞死，比如炎性滲出。免疫組化，看你的目的蛋白的表達情況。

2、免疫組化DAB顯色

DAB和HE一樣也是一種染色劑，HE染色相對簡單，能分辨出細胞中的嗜酸嗜堿性物質(zhì)；DAB顯色是經(jīng)過一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，DAB是被過氧化氫在辣根過氧化物酶催化下產(chǎn)生氧氣所氧化，形成淺棕色不溶性產(chǎn)物，而定位于過氧化物酶活性的部位。

3、什么叫二抗？

比如羊抗兔（二抗），用兔子的免疫球蛋白注射免疫羊，羊就產(chǎn)生可抗兔子免疫球蛋白FC端的抗體。因此所有羊抗兔可以結(jié)合兔子的同種異型抗體，也就是說只要是兔子產(chǎn)生的抗體，羊抗兔（也叫抗抗體或者2抗）都可與之結(jié)合。在試驗中，二抗經(jīng)常被打上了標記，比如辣根過氧化物酶，經(jīng)常被用在ELISA，WESTERN等經(jīng)典的生物學試驗中。

4、封閉非特異性蛋白結(jié)合位點

封閉的原理：固相載體表面(如elisa板，NC膜或者PVDF膜上等)有很多洞洞，通過電轉(zhuǎn)或包被，膠上的蛋白被轉(zhuǎn)移到了膜上，或抗原/抗體固定在板上，蛋白以機械填補(堆積)和吸附的方式結(jié)合于表面。蛋白塞進了表面的很多洞洞里面，但蛋白并不是連續(xù)的，有很多空隙，而且比如說樣品孔之間也有空隙，這些洞洞并沒有填進東西，而抗體也是蛋白，也會被吸附在空的洞里，這樣，就會有很多非特異性的信號。封閉液中的蛋白可以與表面上的空白位置結(jié)合，同樣以機械填補(堆積)和吸附覆蓋的方式結(jié)合在膜上，因為有“填補”和“覆蓋”蛋白結(jié)合位點以避免一抗的非特異結(jié)合，所以有“封閉”的說法。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠很牢固的結(jié)合在空白位置上。這樣，抗體蛋白就不會被非特異性的吸附到膜上，而只會跟特異性蛋白結(jié)合。封閉劑應(yīng)封閉所有的未結(jié)合位點而不替換表面上的靶蛋白、不結(jié)合靶蛋白表位、也不與抗體或檢測試劑有交叉反應(yīng)。

封閉所用試劑：主要為血清，血清封閉原理主要有兩點：是待檢樣本會有些與蛋白非特異性結(jié)合的物質(zhì)，從而導(dǎo)致背景過高，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分非特異性的結(jié)合，從這點看，BSA和血清沒有明顯區(qū)別。第二是待檢樣本中可能會有Fc受體，可以和抗體恒定區(qū)結(jié)合，與抗體特異性無關(guān)，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間結(jié)合。BSA則無法封閉Fc受體。

5、免疫組織化學染色方法

①酶橋法和過氧化物酶―抗過氧化物酶復(fù)合物法。

②親和免疫組織化學法。

酶橋法的基本原理是將酶免疫動物，制備價且特異性強的抗酶抗體．然后用第二抗體作為橋，將抗酶抗體和特異性抗體(即連接在組織抗原上的抗體)連接起來．再將酶結(jié)合在抗酶抗體上．經(jīng)過酶催化底物顯色，從而顯示出抗原所在的部位及含量。

作為橋的第二抗體(即橋抗)必須對特異性抗體(一抗)和抗酶抗體均有特異性，這樣才能將兩者相連起來．因此，一抗和抗酶抗體應(yīng)由同一種屬動物產(chǎn)生。例如，特異性抗體和抗酶抗體均由兔產(chǎn)生，再用羊抗兔IgG作為橋抗將兩者連接起來。

PAP法的基本原理與酶橋法相似，均是利用橋抗將酶連接在抗體結(jié)合的部位，所不同的是，先將酶(過氧化物酶)和抗酶(過氧化物酶)抗體(PAP)制成復(fù)合物，以代替酶橋法中的抗酶抗體和隨后結(jié)合的酶，將兩步合并為一步。這一重要的改進，不僅簡化了操作步驟，而且大大提高了敏感性。PAP法的不足之處是反應(yīng)步驟多，需時長，在實際操作中，會帶來非特異性放大效應(yīng)。親和免疫組織化學結(jié)合了免疫酶組織化學在待檢抗原部位形成有色沉淀和親和組織化學能產(chǎn)生有效抗原信號放大系統(tǒng)的特點，使其敏感性大大增加，操作過程省時，背景清晰。因而成為目前應(yīng)用廣的免疫組織化學方法。

親和免疫組織化學法是從酶橋法和PAP法發(fā)展而來，主要有ABC法和SP法。

ABC法（卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法），ABC法是利用卵白素與生物素*的高度親和力特性，與生物素化二抗結(jié)合，形成抗原＋特異性抗體＋生物素化二抗＋卵白素-生物素-HRP復(fù)合物，后DAB顯色。復(fù)合物配制：先將生物素與酶結(jié)合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物。

SP法（抗生物素蛋白鏈酶素-過氧化物酶復(fù)合物），本身沒有連接生物素，但有兩個生物素親和力*的結(jié)合位點，可以與二抗上的生物素結(jié)合，敏感性高，復(fù)合物不需要使用前混合，更為簡便。