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miRNA熒光定量檢測服務(wù)

更新時(shí)間:2024-09-26

簡要描述:

miRNA熒光定量檢測服務(wù)( realtime fluorescence quantitative PCR,RTFQ PCR)是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析,計(jì)算待測樣品模板的初始濃度??捎糜趍RNA、microRNA、lncRNA等基因表達(dá)量的檢測。

  miRNA熒光定量檢測服務(wù)( realtime fluorescence quantitative PCR,RTFQ PCR)是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析,計(jì)算待測樣品模板的初始濃度??捎糜趍RNA、microRNA、lncRNA等基因表達(dá)量的檢測。

 

miRNA熒光定量檢測服務(wù)常有兩種檢測方法

  1)探針法

  PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收;剛開始時(shí), 探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5’端-3’端外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。

 

  2)miRNA熒光定量檢測服務(wù)染料嵌入法

  使用熒光染料SYBR或EVGreen。熒光染料可以結(jié)合到雙鏈DNA上面,當(dāng)體系中的模板被擴(kuò)增時(shí),熒光染料可以有效結(jié)合到新合成的雙鏈上面,隨著PCR的進(jìn)行,結(jié)合的熒光染料越來越多,被儀器檢測到的熒光信號越來越強(qiáng),從而達(dá)到定量的目的。

 

miRNA熒光定量檢測服務(wù)
  1)引物設(shè)計(jì)
  2)RNA提取
  3)RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
  4)real time PCR 反應(yīng)

  5)數(shù)據(jù)分析

 

miRNA熒光定量檢測服務(wù)結(jié)果
  基因表達(dá)量變化的直方圖、熱圖等,miRNA熒光定量檢測服務(wù)是功能研究的基礎(chǔ),鎖定關(guān)鍵目標(biāo),找到深入研究的方向?qū)ρ芯恐陵P(guān)重要。

  是一類長度約19-24nt的非編碼單鏈RNA,通過堿基互補(bǔ)配對的方式與靶基因的3’-UTR區(qū)部分或*互補(bǔ),剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯,從而起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)的作用。它廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌及病毒的基因組中,調(diào)控生物體生長發(fā)育和疾病發(fā)生等過程中相關(guān)基因的表達(dá)。miRNA的異常表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致生理狀態(tài)的異常和疾病的產(chǎn)生,在多種癌癥中,miRNA的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生明顯改變,有可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。此外,在許多其他的病變組織和細(xì)胞中也檢測到了miRNA的異常表達(dá)。因此對miRNA的表達(dá)的研究具有重要意義。

  1)樣品提供
  a.RNA樣品:取適量新鮮組織,勻漿后抽提總RNA,并提供RNA質(zhì)量檢測圖。
  b.組織樣品:取適量(50-100mg)液氮保存的組織。
  c.血液樣品:加凝固劑并離心,取血清、血漿或全血進(jìn)行分析。
  d.細(xì)胞樣品:取107個(gè)細(xì)胞,吸去培養(yǎng)液后用TRIZOL試劑抽提RNA。

  提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告、詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果、圖表及相關(guān)分析數(shù)據(jù)。

 

miRNA熒光定量檢測服務(wù)中的miRNA是如何產(chǎn)生的?

  miRNAs 是轉(zhuǎn)錄后長片段的 RNA 分子( pri-miRNA )的一部分,首先在細(xì)胞核內(nèi)被雙鏈 RNA 特異的核酸酶Drosha 處理成為 70-100 個(gè)核苷酸組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA ( pre-miRNA )。這一發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA 運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì),被另一個(gè)雙鏈 RNA 特異的核酸酶 Dicer 剪切,得到 19-23 個(gè) 核苷酸組成的成熟的 miRNA ,結(jié)合在與 RNA 介導(dǎo)的沉默復(fù)合物( RISC )類似或者相同的復(fù)合物中,這個(gè)復(fù)合物參與了 RNA 干擾。由 miRNA 和靶基因 mRNA 的堿基配對引導(dǎo) RISC 降解目的片段或是阻礙其翻譯過程。 miRNA 和它的目的 mRNA 互補(bǔ)的堿基配對決定了這個(gè)過程的特異性。通過抑制翻譯還是降解發(fā)揮作用是由 miRNA 和它的目的 mRNA 之間的錯(cuò)配程度決定的,匹配程度高的目的 mRNA 將被降解。由于 miRNAs 可以對不*互補(bǔ)的 mRNA 配對來抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程,因而每個(gè) miRNA 可以有多個(gè)靶基因,而幾個(gè) miRNAs 可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個(gè) miRNA 來經(jīng)濟(jì)地調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá),也可以通過幾個(gè) miRNAs 的組合來精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。對于基于 miRNA 調(diào)控基因表達(dá)的研究的逐步深入,將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復(fù)雜性和復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

 

miRNA熒光定量檢測服務(wù)基本原理

  實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光試劑,利用熒光信號實(shí)時(shí)檢測PCR進(jìn)程,zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠?qū)R?、靈敏、快速、高重復(fù)性地定量起始模板濃度。但是就成熟的microRNA而言,由于其是由21-25個(gè)核苷酸組成的小RNA,長度太短,并不能通過傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測,但是通過特殊設(shè)計(jì)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物,配合實(shí)時(shí)定量PCR引物及探針可以檢測微量樣品中microRNA表達(dá)水平,也可以用終點(diǎn)PCR法定性檢測。

 

  雖然 microRNA 實(shí)時(shí)定量PCR是一種zui近才發(fā)展起來的檢測技術(shù),其技術(shù)細(xì)節(jié)還在不斷完善中,但是microRNA 實(shí)時(shí)定量PCR檢測系統(tǒng),相對其它microRNA檢測技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn):
  1.高特異性 , 可以只對成熟 microRNA 進(jìn)行定量,有效區(qū)分成熟 microRNA 分子和前體分子以及其它成熟 microRNA 的同源分子;
  2.快速,簡單,省時(shí),整個(gè)操作只需兩步,不到 3 個(gè)小時(shí),即可獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù);
  3.檢測靈敏度高,樣品消耗少,僅需 1-10ng 的總 RNA 或 50pg 左右的 microRNA ;

  4.超寬的線性范圍,可跨越 7 個(gè)數(shù)量級;

 

樣品保存及運(yùn)輸

加入有RNAsolidTM試劑的樣本可在37℃保存1~2天,2天以后部分組織中的RNA會(huì)開始降解。室溫(25℃)穩(wěn)定保存1周,不會(huì)有明顯的RNA降解發(fā)生。大部分樣品置于RNAsolidTM試劑中,4℃條件下可穩(wěn)定保存1個(gè)月,不會(huì)有明顯的RNA降解發(fā)生。長期存放可先將保存在RNAsolidTM試劑中的樣本4℃浸透過夜,然后將RNAsolidTM試劑吸出棄去,再將樣本放入-20℃或-80℃長期穩(wěn)定保存3~5年。

 

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