PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；剛開(kāi)始時(shí), 探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。

　　使用熒光染料SYBR或EVGreen。熒光染料可以結(jié)合到雙鏈DNA上面，當(dāng)體系中的模板被擴(kuò)增時(shí)，熒光染料可以有效結(jié)合到新合成的雙鏈上面，隨著PCR的進(jìn)行，結(jié)合的熒光染料越來(lái)越多，被儀器檢測(cè)到的熒光信號(hào)越來(lái)越強(qiáng)，從而達(dá)到定量的目的。

　　5）數(shù)據(jù)分析

　　是一類(lèi)長(zhǎng)度約19-24nt的非編碼單鏈RNA，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶基因的3’-UTR區(qū)部分或*互補(bǔ)，剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯，從而起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)的作用。它廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌及病毒的基因組中，調(diào)控生物體生長(zhǎng)發(fā)育和疾病發(fā)生等過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)。miRNA的異常表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致生理狀態(tài)的異常和疾病的產(chǎn)生，在多種癌癥中，miRNA的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生明顯改變，有可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。此外，在許多其他的病變組織和細(xì)胞中也檢測(cè)到了miRNA的異常表達(dá)。因此對(duì)miRNA的表達(dá)的研究具有重要意義。

　　提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告、詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果、圖表及相關(guān)分析數(shù)據(jù)。

　　miRNAs 是轉(zhuǎn)錄后長(zhǎng)片段的 RNA 分子（ pri-miRNA ）的一部分，首先在細(xì)胞核內(nèi)被雙鏈 RNA 特異的核酸酶Drosha 處理成為 70-100 個(gè)核苷酸組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA （ pre-miRNA ）。這一發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA 運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)，被另一個(gè)雙鏈 RNA 特異的核酸酶 Dicer 剪切，得到 19-23 個(gè) 核苷酸組成的成熟的 miRNA ，結(jié)合在與 RNA 介導(dǎo)的沉默復(fù)合物（ RISC ）類(lèi)似或者相同的復(fù)合物中，這個(gè)復(fù)合物參與了 RNA 干擾。由 miRNA 和靶基因 mRNA 的堿基配對(duì)引導(dǎo) RISC 降解目的片段或是阻礙其翻譯過(guò)程。 miRNA 和它的目的 mRNA 互補(bǔ)的堿基配對(duì)決定了這個(gè)過(guò)程的特異性。通過(guò)抑制翻譯還是降解發(fā)揮作用是由 miRNA 和它的目的 mRNA 之間的錯(cuò)配程度決定的，匹配程度高的目的 mRNA 將被降解。由于 miRNAs 可以對(duì)不*互補(bǔ)的 mRNA 配對(duì)來(lái)抑制蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程，因而每個(gè) miRNA 可以有多個(gè)靶基因，而幾個(gè) miRNAs 可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過(guò)一個(gè) miRNA 來(lái)經(jīng)濟(jì)地調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過(guò)幾個(gè) miRNAs 的組合來(lái)精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。對(duì)于基于 miRNA 調(diào)控基因表達(dá)的研究的逐步深入，將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復(fù)雜性和復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光試劑，利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR進(jìn)程，zui后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠?qū)Ｒ?、靈敏、快速、高重復(fù)性地定量起始模板濃度。但是就成熟的microRNA而言，由于其是由21-25個(gè)核苷酸組成的小RNA，長(zhǎng)度太短，并不能通過(guò)傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測(cè),但是通過(guò)特殊設(shè)計(jì)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，配合實(shí)時(shí)定量PCR引物及探針可以檢測(cè)微量樣品中microRNA表達(dá)水平，也可以用終點(diǎn)PCR法定性檢測(cè)。

　　4.超寬的線(xiàn)性范圍，可跨越 7 個(gè)數(shù)量級(jí)；

樣品保存及運(yùn)輸

加入有RNAsolidTM試劑的樣本可在37℃保存1～2天，2天以后部分組織中的RNA會(huì)開(kāi)始降解。室溫（25℃）穩(wěn)定保存1周，不會(huì)有明顯的RNA降解發(fā)生。大部分樣品置于RNAsolidTM試劑中，4℃條件下可穩(wěn)定保存1個(gè)月，不會(huì)有明顯的RNA降解發(fā)生。長(zhǎng)期存放可先將保存在RNAsolidTM試劑中的樣本4℃浸透過(guò)夜，然后將RNAsolidTM試劑吸出棄去，再將樣本放入-20℃或-80℃長(zhǎng)期穩(wěn)定保存3～5年。